Co-IP结果解读及实验步骤❗

Co-IP是研究蛋白互作常用的实验方法，实验结果解读可见图1-2，实验步骤见图3-7 ⭐Co-IP常见问题及解决办法 1️⃣轻重链条带干扰 👉🏻①选择wb一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰；②选择特殊二抗（A.只识别一抗空间表位的特殊二抗，B.根据目的蛋白分子量选择轻/重链特异性二抗）；③选择标签抗体，将目标蛋白带上HA、Flag等标签，用标签抗体IP，标签抗体技术非常成熟，IP抗体和wb抗体选择不同种属来源；选择纳米抗体磁珠直接IP，可完全避免IP的轻重链，例如【诺一生物】的纳米抗体偶联磁珠就非常nice👍🏻 2️⃣没有检测到目的蛋白或目的蛋白信号弱 ①目的抗体不适用于IP实验，更换IP级抗体或标签抗体②目的蛋白在样品中表达量低或者不表达，加大IP体系的蛋白量或者构建带标签的过表达质粒，转染后再进行CoIP ⭐个人经验：我做的这个蛋白没有商业化的IP级抗体，所以我构建了带HA标签的过表达质粒，用诺一生物的HA抗体偶联磁珠进行IP实验，效果很好 3️⃣非特异性高 ①磁珠对蛋白的非特异吸附，可以用未偶联抗体的磁珠预处理去除非特异性吸附蛋白；②抗体亲和力低导致孵育时间较长，选择高亲和力抗体如纳米抗体，【诺一生物】的抗体偶联磁珠总共孵育时间是30-120min，不仅减少由于孵育时间长导致的非特异结合，还大大缩短实验时间，减少蛋白降解～ Co-IP的常见问题主要是这几个，还有其他问题可咨询交流～