提好蛋白是做好WB实验的第一步❗

‼️提蛋白注意全程低温，提取预冷好离心机，装蛋白的离心管也要预冷 1️⃣细胞铺板：用6cm小皿铺细胞，盖和底都做好标记，“∞”法将细胞摇匀，待细胞密度达90%收样；比克曼的6cm细胞培养皿经过TC处理，细胞贴壁效果很好👌🏻 2️⃣收样：弃旧培基，PBS洗两遍（这时候还是活细胞，不需要预冷PBS），用枪头吸干残余液体，将培养皿置于冰上预冷；如果细胞生长速度不一样，可以先放-80，待收齐后一起提 3️⃣裂解：6cm小皿加120μL裂解液（我用的这个裂解液是直接用无需添加PMSF，如果是用RIPA按100：1加入PMSF现配现用），轻轻晃动小皿使裂解液均匀分布，冰上裂解15分钟 ⚠️趁裂解时间标记好1.5mL离心管，插冰上预冷；离心机预冷至4℃；准备好细胞刮，我用的是比克曼的细胞刮，刮头很宽刮得快😎 4️⃣刮蛋白：用细胞刮将蛋白刮下，刮到边缘，用枪吸取转移至预冷好的1.5mL离心管 ⚠️刮蛋白时在下面垫个冰砖，保持蛋白低温 5️⃣超声：按图9功率进行超声，3-5次，超声会产热，离心管插冰上或者冰盒里降温，超完后立马放冰上；若没有超声机可以涡旋震荡60S 6️⃣离心取上清：4℃ 12000g离心6分钟，将上清转移至预冷好的新1.5mL离心管 7️⃣蛋白定量：BCA测蛋白浓度，计算上样体积，一般上样量30μg 8️⃣煮样：按4：1比例加入5×Loading Buffer，涡旋充分混匀，金属浴100℃煮5min，煮完后冰上冷却