基因过表达操作/瞬转or稳转❓

验证分子和表型的关系，需要通过操纵分子（过表达or沉默）观察表型来建立因果关系 ⭐基因过表达（gene overexpression）是将目的基因CDS克隆到相应的质粒或病毒载体上，利用载体骨架上构建的调控元件，使基因可以在人为控制的条件下实现大量转录和翻译，从而实现目的基因的过表达。 ⭐经验分享 1️⃣过表达质粒构建时建议用慢病毒载体，慢病毒载体既可以瞬转也可以稳转 2️⃣质粒构建是成功的第一步，如果自己不会构建可以找靠谱的公司构，我们组一般都是找公司构，最近硅基生物在搞活动，只需0.4r/bp，PCR产物0.3r/bp，如果基因序列不长的话几百就搞定了3️⃣质粒回来后先扩增，可以先在293T细胞中瞬转确认质粒OK 4️⃣ 稳转和瞬转并不是互斥的，而是根据实验需求和目的的不同选择不同的转染方式；有时候可以结合使用两种转染方法，如先进行瞬时转染进行初步筛选或验证，再进行稳定转染以获得长期稳定表达；在进行转染实验时，应根据具体的研究目标和实验要求选择合适的转染方法和策略 5️⃣做细胞功能实验建议稳转，有些细胞实验周期比较长（如平板克隆和软琼脂克隆），动物实验一定要稳转，稳转可以保证基因长期表达 6️⃣构建稳转细胞株时建议用慢病毒（效率高），脂质体转染可以使少量DNA整合到基因组上（可筛选稳定株但时间较长），浓缩后的慢病毒转染效率高可缩短筛选时间（慢病毒转染之前有分享过） 7️⃣如果载体上有荧光标记，可以荧光显微镜下观察转染效率，但有些荧光标记和目的基因是独立的启动子，所以判断过表达以蛋白水平为准🥸 👉🏻瞬转和稳转实验步骤之前有分享过笔记，还有疑问欢迎留言～ 👉🏻最近硅基生物推出的siRNA三保一套餐只需要699，正好有个基因需要用到就构了一个，敲低效果还不错，下次给大家分享siRNA的转染[大笑R]