手把手教你跑齐内参❗

WB实验步骤多，尽量每一步都做好～ 1️⃣制样 ①收蛋白时尽量保持各孔细胞密度一致，残余液体一定要吸干，加相同体积的裂解液；裂解液不要加太多，尽量控制上样体积在10μL以内，跑出来的条带更好看 ②BCA定量时拿精准的枪保证定量准确 ③100度煮样后冰上冷却，离心将盖子上的水蒸气离下去，涡旋混匀后再上样 2️⃣配SDS-PAGE胶（普利莱Ultragel配胶试剂盒） ①玻璃板和梳子一定要洗干净，过纯水后吹干 ②按普利莱说明书配胶，下层胶4.7mL/块（1.0mm板），上层胶灌满（1.5mL/块），待上层胶凝固后即可上样 ⭐普利莱UltraGel试剂盒可同时分离10-300kDa条带，跑出来的条带锐利整齐（小方块条带非常美观），搭配配套电泳液可以30min跑完电泳，大大节省时间😎 3️⃣电泳 ①电泳液：普利莱试剂盒有附赠快速电泳粉末，使用配套溶液可以达到最佳分离效果，使用时加水溶解定容至1L ②上样：上样前一定要涡旋混匀样品❗根据BCA定量算出的体积上样，上样体积小的样品➕1×loading补齐上样，蛋白marker也要补齐，避免上样体积大的泳道向体积小的挤压 ③电泳：恒压200V，30min左右；普利莱上层胶含有红色染料，方便上样，并且有示踪电泳进程的作用，迁移速度超过溴酚蓝和蛋白，跑在凝胶最前沿，不与蛋白相互作用，不会影响后续步骤 4️⃣转膜➕封闭 ①三明治要做得紧实，但又不能太紧，太紧会导致条带两边深中间浅，太松条带会飞，推荐使用免滤纸海绵大大提高转膜成功率 ②转膜液回收使用一次就可以了，回收太多次会影响转膜效率 ③封闭：5%脱脂牛奶封闭1h（回收牛奶封闭2h） 5️⃣敷抗体 敷一抗二抗时条带与摇床的方向很重要，尽量用抗体孵育盒敷抗体（之前用15ml离心管敷长条带敷不均匀），条带长轴与摇床摇晃方向垂直可避免条带两边粗中间细