这些qPCR实验小技巧研究生一定要知道❗

1️⃣试剂准备：提前将SYBR从-20℃取出（又薅到了GOONIE的试用装😁），解冻后上下颠倒混匀（这一步一定要做，很多试剂低温会析出），置于冰上待用；cDNA（保存与-20或-80均可）也取出解冻～ 2️⃣布板➕计算：横排加cDNA，竖排加引物（三个技术重复），如图三所示计算体系，多配2-3个孔的量 3️⃣配制Mix：我一般将水、引物和SYBR预混，冰上配制mix，加样顺序水→引物→SYBR（先加便宜的再加贵的😆）；引物稀释好后可以1：1混合保存，这样配mix时可避免加了F没加R的情况发生～ 4️⃣点样：将引物mix和cDNA按顺序排好，准备好组里最精准的枪，先加9μLmix（加在靠管底的侧壁），再加1μLcDNA（加在靠管口的侧壁）；加样时吸一打二或吸二打一都可以，两种我都试过，误差都很小，如果枪不好用（打不干净液体），建议吸二打一 5️⃣如何判断qPCR反应良好❓ 扩增曲线呈典型的S曲线，溶解峰为单峰，内参Ct值在合理范围内（通常为13-22之间）；同一模板和引物的复孔Ct值在0.5以内 6️⃣计算相对表达量 ❶计算内参和目的基因Cq值的均值；❷计算△Ct=目的Ct均值-内参Ct均值；❸计算△△Ct=实验组△Ct-对照组△Ct；❹利用power函数计算2^-△△Ct，即可获得相对表达量 ⭐我们课题组提RNA用的是GOONIE快提试剂盒，很好用（之前也分享过提取视频），最近又推出了跑q试剂盒，试剂商小姐姐拿来给我试用嘻嘻，跑出来的数据很稳定（如图9），薅一个试用装可以跑两板q哈哈，大家快冲❗