细胞免疫荧光实验步骤及注意事项～

✅免疫荧光（IF）是用标记的抗体对组织/细胞中相应抗原进行定位、定性或定量分析，实验原理及步骤如图2-3 ✅注意事项 1-根据不同的抗体选择不同的固定液，如磷酸化抗体不选甲醛，会导致磷酸化蛋白从膜表面转移至胞浆中；膜蛋白一般不用醇类或丙酮固定，有机溶剂会破坏膜结构 2-膜蛋白无需透化步骤 3-实验过程勿干片，以免导致非特异性结合 4-若转入的质粒带荧光标签，二抗荧光波长应避开对应的波长 5-将爬片抠起需注意正反面 6-如果要染细胞骨架，可以将染料（如鬼笔环肽）加入到二抗中一起孵育 ⚠️特别提醒：由于支原体污染后做免疫荧光会导致DAPI背景很脏（如图5所示），拍出来的图不可用，所以实验前先清除支原体是很有必要的❗ ⭕️支原体污染的荧光表现：细胞核以外任何视野的DAPI阳性，比较典型的是沿细胞形态一圈；DAPI染色也是检测支原体污染比较快速的方法，4%PFA固定后DAPI染色，共聚焦观察即可判断 ✅如何清除支原体❓ 用过好几款支原体清除剂，对比下来【XR西瑞无限】是zui好用的一个，使用24-48h即可清除支原体，用1✖️工作液对正常培养的细胞不致亖，使用简单，按1：200比例添加至培养基中即可；个人经验👉🏻细胞传代时留少一点细胞，用含支原体清除剂的培养基培养2天即可，轻轻松松解决支原体污染