肠组织紧密连接蛋白WB实验分享～

之前给大家分享过细胞ZO1和CLDN1的wb实验经验，正好最近在做AOM/DSS模型，今天给大家分享一下肠组织紧密连接蛋白的wb实验经验～ 1️⃣制样是关键：每个样品剪取一样的重量，加一样多的裂解液，这样跑出来的内参更容易齐；对于膜蛋白，煮不煮样也很关键，之前分享过ZO1煮不煮样都可以， CLDN1煮样后跑不出来，所以蛋白变性时我分成了两份，一份100℃金属浴5min，一份室温变性30min；Occludin这个蛋白我是第一次跑，两份样品我都敷了一下，发现室温变性发出来的结果更好，大家可以参考这些变性条件～ 2️⃣电泳：由于CLDN1和ZO1分子量差很多，分两块平行胶跑，大分子用7.5%的胶，小分子用12.5%，但这次我用的都是10%的胶也是OK的，120v跑全程 3️⃣转膜：转膜我用的0.22μm PVDF膜、传统转膜液➕20%甲醇，冰浴湿转，CLDN1和Occludin是300mA转45min，ZO1是300mA转90min（之前分享过220mA转2.5h也可以），转膜的时候设置90min，45min的时候将小分子那块三明治拿出来封闭，换个冰砖加点转膜液继续转大分子那块 4️⃣一抗：wb实验要做好，一抗是关键，这几个紧密连接蛋白一抗是在Abmart申请的试用装，发出来条带都很nice，之前试过EMT的也很赞👍🏻，大家可以薅羊毛哦～