大分子膜蛋白怎么跑❓（以ZO-1为例）
粉衣小女孩
2025-05-14 15:02:27
之前分享了小分子膜蛋白怎么跑，有很多同学问大分子膜蛋白咋跑，有求必应，今天就来分享下大分子膜蛋白怎么跑吧（大分子蛋白可参考）～
1️⃣样品到底煮不煮？由于ZO-1是膜蛋白（之前讲过很多膜蛋白煮了后会形成多聚体，影响结果），制备样品时我将蛋白分成了两份，一份煮一份不煮，最后跑出来的结果没啥差别，所以跑ZO-1可以煮样
2️⃣电泳：配7.5%的胶，120v跑全程（这里分享一个用传统电泳液快速跑电泳的方法：把电泳槽放冰水混合物中，150V跑全程，又快跑出来的条带也ok）
3️⃣转膜条件：0.22μm的PVDF膜（因为我们只有这个规格的，大小分子都能用），传统转膜液，湿转，220mA转2.5h（150kDa内转90min是可以的）
关于转膜液：之前刷到跑大分子可以把甲醇调整为10-15%，并加0.1%SDS；但是我用20%甲醇，不加SDS转ZO-1是没问题的，所以250kDa以内的蛋白用这个转膜液没问题，再大的蛋白我暂时还没跑过😊
4️⃣裁膜➕一抗：刚开始我以为ZO-1在220kDa，同时在一张膜跑的E-cad，裁膜从130上面一点点到250上面，幸好上面多余的没有裁掉很多，要是只裁到250那里就曝不出来了，所以平时裁膜尽量裁宽一些，第一次敷新的一抗甚至可以全膜敷看条带到底在哪；ZO-1一抗我用的是Abmart家的，曝光的时候2S就曝出来了，条带很清晰👍🏻[向右R]由于ZO-1含有多个糖基化位点，糖基化修饰会显著增加分子量，ZO-1的理论分子量为220kDa，实际上跑出来的分子量在250kDa左右，我也查了几篇高分文献，文献中跑出来的分子量也在250kDa左右（文献和具体原因在图2）
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